1.
konvansiyonel pcr ile kantitatif pcr (qpcr) yöntemlerini alıp karıştırırsak ortaya çıkan yeni yöntem.
klasik pcr yönteminde end-point ölçüm alıyoruz. yarı kantitatif diyebiliriz çünkü oluşan ürünleri agaroz jelde yürütüp var yok diye kıyaslayabiliyoruz. qpcr ile floresan boya bazlı bir reaksiyon yapıp standart curve veya referans amplifikasyona göre kıyaslayıp fold increase/decrease yorumu yapabiliyoruz. dijital pcr ile floresan boya kullanıyoruz evet ama end point okuma alıyoruz, yani qpcr'daki gibi standart eğri veya referans gen ihtiyacımız yok.
temelde her markanın yöntemi birbirinden değişik ama mantık aynı. reaksiyon alışık olduğumuz gibi tek tüpte, bir kocaman 10ul olarak değil binlerce küçük droplet halinde ayrı ayrı gerçekleşiyor. biorad bunu 20.000 droplet yapmış, qiagen 8500 ile 26.000 droplet arası değişen farklı seçenekler sunmuş, thermo 20.480 droplet demiş, the list goes on and on and on... qpcr gibi her döngü sonunda değil reaksiyon sonunda tek okuma alıyor (ki bu açıdan end-point bir yöntem, tıpkı konvansiyonel pcr gibi), ama okuma aldığı şey floresan boya (prob veya sybr green gibi, evagreen gibi bir dye).
beni tıkla
soldaki figür bir plate. 16 kuyucuk varmış plate üzerinde. yakınlaşınca her bir kuyucuğun binlerce nano kuyucuğa bağlı olduğunu, daha da yakınlaşınca her bir nano kuyucuğun da bir diğerine bağlı olduğunu görüyoruz. en sondaki figürde ise okuma ekranını görüyoruz. eğer bir nano kuyucukta (droplet içinde) reaksiyon gerçekleşirse o kuyucuktan okuma alınacağı için kuyu floresan ışık altında parlıyor, gerçekleşmezse parlamıyor. cihaz da buna göre bir pozitif negatif skoru verip poisson dağılımına göre absolute copy number veriyor bize. bu yönü de kantitatif oluyor işte, ama standart curve kullanmadan veya relative expression karşılaştırmadan, direkt copy number düzeyinde bir kantitasyon.
güzel teknik. ama pahalı.
klasik pcr yönteminde end-point ölçüm alıyoruz. yarı kantitatif diyebiliriz çünkü oluşan ürünleri agaroz jelde yürütüp var yok diye kıyaslayabiliyoruz. qpcr ile floresan boya bazlı bir reaksiyon yapıp standart curve veya referans amplifikasyona göre kıyaslayıp fold increase/decrease yorumu yapabiliyoruz. dijital pcr ile floresan boya kullanıyoruz evet ama end point okuma alıyoruz, yani qpcr'daki gibi standart eğri veya referans gen ihtiyacımız yok.
temelde her markanın yöntemi birbirinden değişik ama mantık aynı. reaksiyon alışık olduğumuz gibi tek tüpte, bir kocaman 10ul olarak değil binlerce küçük droplet halinde ayrı ayrı gerçekleşiyor. biorad bunu 20.000 droplet yapmış, qiagen 8500 ile 26.000 droplet arası değişen farklı seçenekler sunmuş, thermo 20.480 droplet demiş, the list goes on and on and on... qpcr gibi her döngü sonunda değil reaksiyon sonunda tek okuma alıyor (ki bu açıdan end-point bir yöntem, tıpkı konvansiyonel pcr gibi), ama okuma aldığı şey floresan boya (prob veya sybr green gibi, evagreen gibi bir dye).
beni tıkla
soldaki figür bir plate. 16 kuyucuk varmış plate üzerinde. yakınlaşınca her bir kuyucuğun binlerce nano kuyucuğa bağlı olduğunu, daha da yakınlaşınca her bir nano kuyucuğun da bir diğerine bağlı olduğunu görüyoruz. en sondaki figürde ise okuma ekranını görüyoruz. eğer bir nano kuyucukta (droplet içinde) reaksiyon gerçekleşirse o kuyucuktan okuma alınacağı için kuyu floresan ışık altında parlıyor, gerçekleşmezse parlamıyor. cihaz da buna göre bir pozitif negatif skoru verip poisson dağılımına göre absolute copy number veriyor bize. bu yönü de kantitatif oluyor işte, ama standart curve kullanmadan veya relative expression karşılaştırmadan, direkt copy number düzeyinde bir kantitasyon.
güzel teknik. ama pahalı.
devamını gör...
"dijital pcr" ile benzer başlıklar
pcr
8